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如何找到合适的二抗

二抗结合一抗以允许检测、分选和纯化目标抗原。由于它们对一抗种类和同种型具有特异性,因此可以检测感兴趣的蛋白质。是否需要使用二抗取决于您的抗体检测方法。


直接与间接检测方法

检测目的抗原的方法可以是直接的或间接的(图1):

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直接:通过直接与标记物偶联的一抗(即偶联一抗)来检测抗原,因此不需要二抗。

间接:抗原由结合的二抗检测,该二抗针对一抗的宿主物种产生并与一抗结合。间接方法可提供更高的信号强度。因为多种办法标记的二抗可以间接结合每种抗原(图1)。间接检测还可以包括放大步骤以增加信号强度。

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直接或间接检测的选择通常取决于靶抗原的表达水平。直接检测合适分析高表达的抗原。相反,间接检测更适合研究表达不良的抗原,这受益于二抗提供的信号放大。



图1.使用荧光团标记的抗体直接和间接检测抗原的示意图。


在为您的实验选择最合适的方法之前,这两种方法都有一些有点和局限性需要考虑(表1)。

表1.直接检测方法与间接检测方法的比较。

直接检测

间接检测

时间

通常较短,因为只需一个贴标步骤。

使用共轭二抗需要额外的步骤和更长的时间。

复杂性

协议中的步骤较少,因此是一种更直接的方法。

在多重实验中,您需要选择合适的二抗或抗体组合,这增加了实验的复杂性。

敏感性

与间接法相比,信号可能会显得较弱,因为没有二抗,而二抗通常可以放大信号。

多种二抗可能与一抗结合,从而产生放大信号。

背景

非特异性结合降低。

含有内源性免疫球蛋白的样本可能会出现较高的背景值。

选择直接结合的一抗

使用直接共轭的一抗(例如,与酶标记或荧光标记物共轭)可以加快和简化方案,省去二抗染色步骤。此外,共轭一抗还能使物种交叉反应最小化,消除二抗可能出现的非特异性结合。荧光共轭一抗是进行多色实验的理想工具,因为它们能让您灵活地组装所需的多重面板。

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选择一抗共轭物时要注意抗体的特异性。最好选择重组单克隆抗体,这种抗体特异性高,批次间一致性好。


选择合适的第二抗体

如果使用间接检测,则需要选择合适的二抗。

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二抗是通过用作为免疫原的抗体对动物进行免疫而产生的。产生的二抗将与动物免疫过的抗体类型结合。

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二抗的描述性名称揭示了与之结合的一抗的类型。这些名称包括前缀 "抗",表示它们的反应性。例如,如果动物用兔IgG进行免疫,产生的二抗将与兔IgG结合,称为抗兔IgG。

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在选择第二抗体时,您需要考虑它是否能选择性地与第一抗体结合并使您能检测抗原,这取决于以下几个关键因素。


寄主物种

用于培养二抗的宿主物种必须与一抗不同。例如,如果一抗是在兔体内培养的,那么二抗就需要在其他物种体内培养;驴抗兔二抗就很合适。


图2. 利用二抗的名称来了解它与哪一物种发生反应。二抗在驴体内培养(A),与兔抗体结合(B)。


结合同型性和特异性

二抗必须与一抗的同种型结合。

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一抗通常为IgG同型。因此,二抗需要与IgG结合。通常,抗IgG二抗与重链和轻链(H&L)结合,但也可与一抗的其他区域结合。



图3. 利用二抗的名称了解其结合的一抗的种类、同种型和区域。该第二抗体与兔IgG的H&L区域特异性结合(B、C、D)。


为不同应用选择共轭物

将荧光染料、蛋白质、酶和生物素等标签与二抗结合,可观察到目标蛋白质的存在。

荧光标签在一定波长的光激发下会发出可视范围内的光。荧光标签有几种,都有各自的激发和发射特性。

酶标记物,如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),与适当的底物结合会形成彩色沉淀。

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生物素化抗体在与阿维菌素-生物素-酶或荧光染料复合物(通常简称为ABC试剂)(即与酶或荧光染料共轭的阿维菌素或链霉亲和素)结合后可用于信号放大。


图4. 二抗标签通常标在抗体名称的末尾。这种二抗与绿色荧光团Alexa Fluor? 488连接。


共轭物的选择取决于应用。酶联二抗在ELISA或Western印迹应用中最受欢迎。相反,在流式细胞仪和ICC中,人们更倾向于使用与荧光蛋白或染料(如Alexa Fluor?)连接的二抗。

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下面我们将针对您可能使用的主要应用(表2)列出一些建议的二抗。


表2. 为不同应用选择标记有酶或荧光色素的二抗。

二抗

荧光

IHC

HRP、HRP 聚合物、生物素(与酶或荧光素结合的阿维丁/链霉亲和素)

Alexa Fluor?, Cy?dyes, FITC, PE

ICC

/

Alexa Fluor?, Cy?dyes, FITC, PE

Western Blot

HRP, AP

IRDye?, Alexa 680, Alexa 790

ELISA or ELISPOT

HRP、生物素(与酶或荧光素结合的阿维丁/链霉亲和素)

/

Flow Cytometry or FACS

/

Alexa Fluor?, Cy?dyes,? FITC, PE

IHC =免疫组织化学,ICC =免疫细胞化学,FACS =荧光激活细胞分拣,HRP =辣根过氧化物酶,AP =碱性磷酸酶


参考文献

1.?https://ptglab.com/news/blog/secondary-antibody-selection/?Secondary antibody selection guide

2."Secondary Antibodies as Probes".?www.thermofisher.com. Retrieved?2017-05-31.

3."F(ab')? Fragment Secondary Antibodies - Jackson ImmunoResearch".?www.jacksonimmuno.com. Retrieved?2021-01-29.

4."Fab Fragment Secondary Antibodies - Jackson ImmunoResearch".?www.jacksonimmuno.com. Retrieved?2021-01-29.

5."Secondary antibody review based on formal publications".?secondary-antibody.com. Archived from?the original?on 2008-04-17. Retrieved?2008-04-16.

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