首页
400-620-6333
荧光探针--吸收与荧光
光的吸收
除了部分或完全透明物质中的折射，散射，干涉和衍射现象可以产生色彩印象，如彩虹、蓝天、闪闪发光的肥皂泡、华丽的孔雀羽毛或薄薄的油膜层之外，我们环境中的颜色主要是通过光的吸收或反射而产生的。
?
物质的“色彩”是由于选择性吸收电磁辐射光谱的可见部分的光而产生的。该范围位于紫外光和红外光之间。在分子水平上，这意味着分子进入电子激发态：通过吸收光量子（光子），电子从最高占据的分子轨道（HOMO;能量E1)进入最低未占据分子轨道（LUMO;能量E2)。
被吸收光子的能量恰好对应于两个能级之间的能量差，即分子只能以离散的能态存在，能量是“量子化的”并且只能以限定的部分被吸收或释放。
紫外/可见光谱
可以测量光的吸收（例如染料溶液中的吸收）。定量紫外/可见光谱的基础是朗伯-比尔定率。
通过变换方程，可得到化合物的浓度
朗伯-比尔定律适用于单色辐射。通过应用整个波长的吸光度，可以获得化合物的完整紫外/可见光谱。
?
对于较高浓度的溶液以及浓度依赖性反应（例如染料的聚集）的发生，朗伯-比尔定律失去了有效性。
?
当光束穿过溶液时，光束衰减，部分光被溶液中的分子吸收，即忽略散射和反射：
因此，
?
朗伯-比尔定律中的比例常数是与波长相关的材料常数，描述了允许激发的所谓跃迁概率。光谱选择规则适用，即允许的跃迁和禁止的跃迁之间存在区别。最重要的选择规则是保持多样性（见下文）。允许的跃迁具有较高的跃迁概率，因此具有较高的消光系数。对于有机染料，长波吸收最大值处的消光系数>105L?mol-1cm-1；这些是共轭p电子系统内允许的跃迁。
雅布隆斯基图
吸收是一个非常快的过程（10?-15至10?-14秒），无需旋转反转。分子通过吸收光子而吸收的能量在激发态的有限寿命后以不同的形式释放。如果排除光化学反应，除了以热能形式释放之外，还可能以荧光或磷光的形式发光。这些光物理基本过程（其中保留了分子的化学特性）可以以Jablonski图或Jablonski项方案的形式图形化表示。
除了电子水准仪S0?- S2和T1，显示了相应的振荡子级别。辐射过程（波浪线）和非辐射过程（虚线）之间存在区别。
?
单线态S只有成对电子，总自旋S = 0；三重态T有两个不成对电子，总自旋S = 1；这导致重数M = 2 S + 1（存在磁场时的能级数）。对于单重态，M = 1，对于三重态，M = 3。因此，保持多重性的选择规则仅允许在单重态或三重态系统内进行跃迁。
荧光
荧光（10?-9至10?-7?s）表示在受激分子失活期间，通过从第一激发单重态S1的最低振动能级跃迁到电子基态?S0的振动能级（即等多重状态之间）（“Kasha规则”）。因此，观察到的荧光与激发波长无关。
?
G.G. Stokes以发光矿物萤石（CaF2）命名荧光，荧光的出现可根据经验与有机分子的某些结构特征联系起来：非芳香烃不显示荧光；即使像番茄红素那样显示出 11 个共轭双键，而芳香族化合物几乎完全是荧光的。因此，在许多情况下（但并非所有情况下），芳香族化合物中经常出现的刚性扁平分子结构可被视为具有良好荧光能力的先决条件。研究还表明，在芳香烃中引入某些基团会减弱荧光。硝基就是其中之一，它可以阻止硝基苯等发出荧光。
系统间交叉（ISC）
溴原子或碘原子也会减少荧光，这被称为内部重原子效应。这些取代基通过更大的自旋轨道耦合，促进向三重体系的过渡，而三重体系实际上是自旋所禁止的。这种单重子系统和三重子系统等能振动水平之间的相互转换被称为 "系统间转换"（ISC）。具有未配对电子的顺磁性物质，如分子氧 O2，也可以作为催化剂介导这种转变。
磷光
三重态T1的振动基态在电子基态S0的振动水平上失活时发出的光称为磷光。与只能在激发过程中观察到的荧光不同，磷光即使在激发结束后也可能持续较长时间（"余辉"）。这反过来又与保持倍率的规则有关，倍率会导致三重态的寿命延长（10-4到102秒），从而延迟失活到单重基态。
斯托克斯偏移
由于荧光或磷光总是从电子激发态 S1?或 T1?的振动基态 v0?开始的，因此发射波段总是比激发波段（即浴色）偏移到更高的波长。与荧光相比，磷光向长波长的偏移更为强烈。
内部转换（IC）
此外，一种被称为 "内部转换"（IC）的失活现象也会发生，例如，从第一电子激发态 S1 的振动基态过渡到电子基态 S0?的等能振动水平。从这种较高的激发振动级开始，振动弛豫（10-12?秒）并释放热量。这种无辐射失活过程总是比发光过程更快。这一过程似乎对非常灵活的分子特别有效。因此，脂肪族化合物几乎只发生内部转变，进入电子基态，而不会发出荧光。对于大多数其他分子来说，无辐射失活过程也主导着发光过程。
荧光染料
只有极少数有机染料的无辐射失活速度足够慢，因此从激发态到基态的跃迁变得非常重要，多余的能量通过发射光子作为荧光释放出来。
?
荧光染料的光谱特性包括激发和发射光谱、荧光量子产率（ηfl）和荧光衰减时间（Tfl）。染料的荧光与激发波长无关。
选择染料作为荧光标记时需要考虑的因素将在相应章节中介绍。
光谱特性
荧光染料的光谱特性与分子结构密切相关。为了使分子的吸收在可见光波长范围内（400 - 700 nm），基态和激发态之间的能量差必须足够低。有机染料最显著的结构特征是共轭对电子系统，即所谓的 "发色团"（希腊语：颜色载体）。
?
罗丹明染料的吸收
在大多数 ATTO 染料中，发色团具有刚性分子骨架。其中的许多代表属于罗丹明染料家族。作为一个共同的结构元素，这些染料在一个氧杂蒽分子的中心碳原子上有一个羧基取代基。
?
羧基（红色）位于 2-位或正交位，对所有罗丹明的物理化学特性都有重大影响。
由于存在游离的正羧基，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有特殊的特性，在使用这两种荧光团时需要加以注意。这两种染料在苯环的4位或5位上都带有一个额外的羧基作为偶联基团，从而使ATTO 565和ATTO 590适合用作荧光标记：
吸收波长与?pH 值的关系
正羧基非常靠近发色团，因此这种酸性官能团的质子化-质子化平衡对罗丹明染料的光学特性有很大影响。
因此，质子化和去质子化形式的ATTO 565和ATTO 590的吸收最大值是不同的。例如，相对于质子化染料（添加三氟乙酸），ATTO 565在乙醇中的去质子化（添加三乙胺）吸收最大值偏移了16纳米，波长更短（低色度）：
染料-螺内酯平衡
ATTO 565和ATTO 590的去质子化形式可以形成无色的螺内酯： 在中心碳原子受到羧酸阴离子的亲核攻击后，形成一个五元环（内酯），打断了氧杂蒽的发色团。因此，该化合物变为无色，即在光谱的可见光范围内不再吸收和发出荧光：
?
平衡中螺内酯所占的比例很大程度上取决于溶剂、pH值、温度和染料的化学结构。在极性非沸腾溶剂中，平衡几乎完全有利于螺内酯。因此，ATTO 565和ATTO 590在无水丙酮中的溶液几乎是无色的。然而，在水或乙醇等极性质子溶剂中，平衡几乎完全有利于染料形式。
荧光光谱
在大多数情况下，染料的荧光光谱是长波长吸收带的镜像，这一点在 ATTO 514 的例子中体现得淋漓尽致：
与吸收最大值相比，荧光最大值通常会向长波移动25-40纳米。这种所谓的斯托克斯偏移还受到激发态寿命期间染料周围溶剂分子重新定向的影响。因此，发射是从能量较低的 "溶剂弛豫状态 "开始的。激发过程中电子分布的变化越大，能量差也就越大，因此斯托克斯位移也就越大。我们的ATTO LS染料就实际应用了这一点。
荧光量子产率?(ηfl)
荧光染料最重要的特性之一是荧光量子产率（ηfl）。量子产率描述的是发射光子数（nfl）与吸收光子数（nabs）之比。
?
ηfl?= nfl?/ nabs
?
因此，荧光量子产率永远不会超过100%。如上所述，无辐射失活过程通常会与荧光竞争，从而降低量子产率。
?
对于利用荧光研究染料而言，高荧光量子产率当然是有利和理想的。
荧光衰减时间（Tfl）
荧光光子在激发后的发射是一个统计过程。因此，单个分子保持激发态的时间也是一个统计量。但是，如果考虑到由许多相同分子组成的集合体，就会得出一个定义明确的衰减统计量。用短激光脉冲激发后，在最简单的情况下，激发态分子的数量会以指数形式减少。激发分子数（n1）下降到系数1/e(约37%)之后的时间称为荧光衰减时间（Tfl）。
?
n1(t) = n1(0) exp(- t / Tfl)
?
荧光衰减时间是染料的一个重要特性，可用来识别染料。ATTO染料的Tfl值通常在纳秒范围内。
分子相互作用
染料的荧光衰减时间和荧光量子产率并非恒定值，而是受染料所处环境（即溶剂和温度）的影响。染料的衰减时间和量子产率并不是相互独立的，它们之间存在以下关系：
?
Tfl?= T0?× ηfl
?
T0是在无辐射失活（ηfl?= 100%）情况下的所谓自然寿命。
因此，荧光衰减时间的变化可以提供染料分子局部环境变化的信息。
?
参考文献
M.F. Vitha,?Spectroscopy, Principles and Instrumentation, Wiley-VCH,?2018, ISBN 978-1-119-43664-5.
T. F?rster,?Fluoreszenz organischer Verbindungen, Vandenhoeck & Ruprecht, G?ttingen,?1997?(Reprint), ISBN 3525423128
K. H. Drexhage,?Structure and Properties of Laser Dyes, in: F. P. Sch?fer, Dye Lasers, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg,?1973.
M. Klessinger, J. Michl,?Excited States and Photochemistry of Organic Molecules, Wiley-VCH, Weinheim,?1995, ISBN 0471185765.
W.A. Bingel,?Theorie der Molekülspektren, Verlag Chemie, Weinheim,?1967.
Textbooks of Physical and Theoretical Chemistry.
危险品化学品经营许可证（带存储）