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流式细胞术
流式细胞术允许通过狭窄、快速流动的液体流分离悬浮液中的细胞或颗粒样品。当样品通过激光时，可以检测样品中单个细胞颗粒的尺寸、粒度和荧光特性。通过这种方式，异质生物样品的组合物可以被解卷积，例如血液中的T细胞或海水中的光合微生物的识别。通过使用针对仔细选择的表面蛋白标记抗体，可以实现对样品的更精细的了解，例如区分激活和非激活的T细胞。在下文中，样品将被称为“颗粒”并且可以是任何颗粒或细胞。
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当颗粒与电流同时穿过开口时，阻抗的变化与颗粒的尺寸相关，这被称为库尔特原理。当颗粒具有低电导率时(如细胞的情况)，这特别有用。Mack Fulwyler于1965年发明的第一台细胞分选仪采用了Coulter原理来计数和测量颗粒大小。Leonard Herzenberg扩展了该技术，他创造了FACS(荧光激活细胞分选仪)这一术语。首字母缩写词FACS是Becton Dickinson的商标并拥有。虽然许多科学家经常将这个属于用于所有类型的分选和非分选应用，但它并不是流式细胞术的通用术语。
技术
将带有感兴趣颗粒的荧光标记样品连接到流式细胞仪，其中颗粒将通过流体动力学聚焦定向为被高速流体(片状流体)包围的细流。将一束激光照射到流体流上，并且多个探测器瞄准同一点。不同的检测器感测与光束一致的前向散射光(FSC)、垂直于光束的侧向散射光(SSC)以及一组或多组荧光分子。FSC与颗粒提及相关，SSC取决于颗粒的内部复杂性。通常，穿过光束的0.2至150微米范围内的颗粒会以基于SSC或FSC的可检测水平散射光。散射光与颗粒内部或颗粒表面附着的化学物质发出的荧光相结合，被探测器识别。分析每个探测器(每个荧光发射峰一个)的亮度波动，从而可以得出有关每个单独例子的物理和化学结构的各种类型的信息。现代仪器通常具有多个激光器和荧光检测器，可实现更复杂的实验设置。使用流式细胞仪从样品中收集数据的过程称为“采集”。采集有连接到流式细胞仪的计算机和处理与细胞仪的数字接口的软件介导。该软件能够调整待测样品的参数(即用于放大信号的PMT电压，以及补偿荧光通道之间的泄露)，并在采集样品数据时协助显示初始样品信息，以确保参数设置正确。通常，流式细胞仪在样品采集之前有五个主要组件，图1：
A.?流动池，其中携带细胞/颗粒的液流(鞘液)对齐，以便细胞/颗粒以单列方式通过光束进行传感。
B.?当今常用的测量系统包括不同波长(蓝色、绿色、红色、紫色)的二极管激光器，产生光信号
C.?检测器(最常见的时光电倍增管(PMT))和模数转换(ADC)系统，该系统生成FSC和SSC以及从光到可由计算器处理的电信号的荧光信号。
D.?放大系统(线性或对数)
E.?用于分析信号的计算器
图1:流式细胞术的一般原理。异质细胞样品(A)由荧光抗体(B)标记，样品颗粒聚焦在流体流(G)中，改流动一次循序一个例子到达光源(D)。根据粒子的性质，光会发生不同程度的散射或荧光。在计算机图中信号放大后对此进行检测，其中可以绘制感兴趣粒子周围的门(蓝色和红色)(E)。某些流式细胞仪器配备有分选功能，允许将具有所需特性的门控颗粒转移到收集容器(F)中。
流式细胞术中的抗体
抗体是流式细胞术中负责生物样品有意义的反卷积的重要工具，因为它们可以精确定位细胞表面上的特定标记蛋白。您使用的标记越多，您获得的每个细胞的信息就越多；您拥有的抗体越多，您可以获得的信息就越多。然而，可用的不同荧光染料的数量以及FACS机器中可以安装的激光器和检测器的数量都存在限制。目前，一些最先进的流式细胞仪配备7个激光器和49个不同的检测器。
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最近一项称为质谱流式细胞术的技术正在克服荧光染料的一些二局限性。相反，抗体用稀土金属标记，因此可以同时检测40种不同的抗体。
通过流式细胞术分类
荧光激活细胞分选(FACS)时一种独特类型的流式细胞术。它允许基于检测道德光散射对单细胞/颗粒进行分选，或者分选到管或微量滴定板中，一次一个细胞。携带细胞的狭窄液体流(片状液体)可以进行分离，因此一次只有一个细胞到达检测器。为了分离细胞流中的特定细胞，振动机制使细胞流分解成单独的液滴。系统经过调整，每个液滴出现多个细胞的可能性较低。就在液流分解成滴液之前，液流通过激光器和检测器，确定散射和荧光参数。电厂正好放置在水流分裂成液滴的位置。根据之前的荧光强度测量，施加电荷，当液滴从流中破裂时，相反的电荷被捕获在液滴上，然后带点的液滴通过静电偏转系统落下，该系统将液滴转移到微量滴定板上的管或孔中。
具体例子
流式细胞术通常用于许多研究和诊断领域。在医疗保健领域，流式细胞术用于诊断不同的疾病，包括血癌，并有助于移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学和性别预选精子分选等领域的其他临床决策。在海洋生物学中，流式细胞术可以利用光合浮游生物的自发荧光特性来表征丰度和群落结构。在蛋白质工程中，流式细胞术与酵母展示和细菌展示结合使用，以识别具有所需特性的细胞表面展示的蛋白质变体。
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细菌展示和分选可用于表位作图。抗体与细菌文库一起孵育，其中每种细菌在其表面上展示特定类型的肽，用于表位作图目的。检测到两种荧光信号：抗体-肽结合(蓝色萤光团)和与粉红色对照蛋白结合的归一化标签的表面表达(红色萤光团)。一些文库成员(细菌B和细菌C)不表达抗体识别的肽，它们仅允许检测红色荧光。为了从非结合肽的背景中找出结合物，在表达和结合细菌群体周围绘制一个门(用蓝色矩形标记)，并设置流式分选机将这些细胞收集到容器中(蓝色管)。使用相同的原理，可以对非结合肽进行分类并收集到另一个容器(红管)中。
图2:用于表位作图的细胞群的鉴定和门控。肽(紫色)显示在细菌表面并于标记抗体一起孵育。此后，根据细菌的特性对细菌进行分类。
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表位作图设置的典型结果如图3所示。将针对癌症蛋白HER2的人类蛋白图谱(HPA)抗体与肽库一起孵育。然后，通过在表达感兴趣的肽的细菌周围再画一个门(1)并在分选模式下运行流式分选机来收集它们，从而分离出表达感兴趣的肽的细菌。然后将收集到的样品再流式分选机中进行分析；同一区域(2)内点(细菌)的富集表明分选成功。然后可以对从门2收集的细菌进行再次分选并进行DNA测序以获得其表面表达的表位肽序列。
图3:使用细菌展示和细胞分选对HER2抗体进行表位作图。将针对癌症蛋白HER2的HPA抗体与肽库一起孵育，并应用门控来收集具有特定特性的细菌。
参考文献
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