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如何选择和使用抗体—一抗


选择一个一抗

一抗是直接与目标蛋白质结合的抗体,其可变抗体区可识别蛋白质的表位。选择一抗时要考虑以下几点:

抗体克隆和制造方法

克隆性取决于抗体是来自不同的B细胞(多克隆抗体),或来自母克隆的相同B细胞(单克隆抗体)。这些抗体具有不同的优势和局限性。

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概括地说,多克隆抗体由异质的抗体混合物组成,每种抗体都能识别特定抗原的不同表位。通过与多个不同的表位结合,多克隆抗体可在相关应用中产生针对目标抗原的强信号,而不会偏向于单一表位。不过,多克隆抗体的供应有限,批次间的差异很大,而且具有交叉反应性,缺乏特异性。

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与多克隆抗体相比,单克隆抗体只能识别每个抗原的单一表位。单克隆抗体对靶点的特异性高,非特异性交叉反应低,批次间的差异极小。

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“重组"一词是指利用合成基因在体外生产的抗体。与传统的单克隆和多克隆抗体相比,重组抗体可提供长期、安全的供应,且批次间的差异极小。由于抗体的编码序列是已知和确定的,因此可以根据预期用途对其进行进一步的设计和操作。

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我们建议在有适合特定目标和应用的克隆时使用重组单克隆抗体,以确保实验的可重复性和抗体的长期供应。对于传统上使用多克隆抗体的应用(如分析低丰度靶标或同时检测多种翻译后修饰),重组多克隆抗体可以提供理想的解决方案。重组多克隆抗体是精心挑选的单个重组单克隆抗体的混合物,旨在识别同一抗原上的不同表位。因此,它们可以提供只有重组抗体才能提供的出色的灵敏度、特异性和再现性。

通过基因敲除验证确认抗体特异性

好的抗体具有目标特异性,即使在低表达水平下也能识别感兴趣的蛋白质。然而,许多研究表明,并非所有抗体都具有这种特异性,许多抗体会与非目标蛋白产生交叉反应。

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基因敲除(KO)验证是抗体特异性最公认、最可靠的验证方法之一。通过在KO细胞系、细胞裂解液或不表达目标蛋白的组织中进行测试,这种稳健的技术可以确认抗体的特异性。特异性抗体应在KO细胞系中不产生信号,但在野生型细胞系中产生特异性信号。这样,KO验证就成了真正的阴性对照。

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下图14显示了在免疫细胞化学(ICC)中对Ki-67抗体进行KO验证的实例,Ki-67基因敲除的HAP1细胞(底部)显示没有Ki67(绿色)表达。


图14. 野生型细胞(上)和Ki67基因敲除HAP1细胞(下)中Ki67抗体敲除检测的免疫细胞化学/免疫荧光图像。绿色是抗Ki67 (ab92742)与山羊抗兔IgG(Alexa Fluor? 488),红色是抗α-微管蛋白(Alexa Fluor? 594),蓝色是用DAPI标记的核DNA。

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我们建议您选择经过多次应用验证的抗体,最好使用KO技术。或者您也可以使用适当的KO细胞系、KO细胞裂解物或组织自行验证抗体。

免疫原详细信息

抗体的发现通常始于用免疫原对宿主动物进行免疫。这些免疫原可以是全长蛋白质、多肽或整个细胞。

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使用的免疫原将决定抗体与蛋白质的哪个区域结合。例如如果您想通过FACS检测活细胞上的细胞表面蛋白,则应选择针对该蛋白胞外结构域的抗体。

样品处理

抗体对特定构象的表位具有特异性。由于样本处理会改变表位构象(例如,固定会导致蛋白质因甲醛诱导亚甲基桥而交联),因此有些抗体只对以特定方式处理的样本有效。许多抗体只能识别经过还原和变性的蛋白质,因为这样才能显示出原本会被遮盖的表位。另一方面,有些抗体只能识别原生状态蛋白质上的表位。

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对于免疫组化,有些抗体只适用于未固定的冷冻组织。其他经过福尔马林固定和石蜡包埋的抗体则需要抗原回收步骤来暴露表位。

宿主种类

如果您打算使用二抗进行间接检测,最好选择与样品不同物种的一抗。这样可以避免二抗(抗免疫球蛋白)与样品中的内源性免疫球蛋白产生交叉反应。例如,如果您研究的是小鼠蛋白质,则应选择在小鼠以外的物种(如:兔)中培养的一抗。由于交叉反应是由样本中存在的宿主抗体引起的,因此这对组织样本来说是个陷阱,但对细胞系来说不是。

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假设您必须使用与组织样本具有相同宿主物种的一抗。在这种情况下,您需要仔细考虑如何修改方案以减少背景染色。或者,为了避免交叉反应,您可以使用由不同物种的结构域组成的嵌合抗体。

在使用不含任何内源性免疫球蛋白(IgG)的细胞裂解物进行Western印迹等应用或使用一抗共轭的直接检测实验时,您无需担心一抗的宿主物种。

载体和防腐剂

通常抗体被储存在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中,其中含有牛血清白蛋白(BSA)等载体蛋白以及甘油和叠氮化钠等防腐剂。虽然这些都是保持抗体稳定性和防止污染的重要成分,但它们会妨碍标签(如荧光染料、酶和金属)的有效连接,影响活细胞系统,甚至可能干扰高度专业化的硬件设置。

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在典型的共轭反应中,BSA会与一抗竞争吸附到相关标签上,从而大大降低共轭效率。抗体溶液中的叠氮化钠会对细胞产生毒性,从而限制抗体在细胞培养中的使用,并对连接产生负面影响。因此,如果您打算共轭一抗或用一抗染色活细胞,我们建议您选择不含载体或防腐剂的抗体配方。

参考文献

1.Weber et al. (2017) From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Experimental and Molecular Medicine. Vol. 49: e305

?2.Rajewski, Klaus (1996) Clonal selection and learning in the antibody system. Nature. Vol. 381: 751-758.

3.Cheung et al. (2012) A proteomics approach for the identification and cloning of monoclonal antibodies from serum. Nature Biotechnology. Vol. 10(5): 447-454

4.Ascoli and Aggeler (2018) Overlooked benefits of using polyclonal antibodies. BioTechniques 65(3): 127-136


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