聚乙二醇修饰剂(PEG)的一般共轭反应——聚乙二醇醛(PEG-CHO)
聚乙二醇(PEG)修饰剂是化学官能化聚乙二醇的载体,由于其水溶性和非免疫原性,在科学研究领域被广泛应用于化学耦合、药物递送、纳米粒子功能化修饰、化学生物学以及生物标记等,其强大的功能性引起了人们强烈的研究兴趣,接下来将为大家一一展示9种常见的聚乙二醇修饰剂的一般共轭反应。
聚乙二醇醛(PEG-CHO)
简介聚乙二醇醛试剂可用于生物偶联,通过醛基与氨氧基反应生成醛肟,比腙和亚胺的性质要更加稳定,在大多数情况下,可以不经还原直接使用。而联胺和亚胺键键通常需要还原才能形成稳定的C-N键。
烷氧胺与羰基在无胺、中性条件下(pH=6.5-7.5)的反应效率最高。羰基可能存在于多糖的还原端,而如果要生成额外的羰基,可以使用特定的氧化酶,如半乳糖氧化酶,或1-10 mM的高碘酸钠,或使用Ald-PEG-NHS酯修饰剂来引入醛基。尽管中性缓冲液如磷酸盐缓冲盐水也可以使用,但高碘酸盐氧化的最佳条件依旧是在酸性环境下,如pH=5.5的0.1 M醋酸钠溶液。如果氧化是在酸性条件下进行的,缓冲液交换透析或凝胶过滤到中性缓冲液中能够帮助实验者获得最佳的烷氧胺化的反应;苯胺可用于加速肼和烷氧胺基团与反应性醛/酮(羰基)的偶联速率。?
图1:肟键的形成是一种特殊的生物正交反应,使用合适的催化剂可以大大加速肟的形成
a. 醛基与氨氧基反应时肟键形成示意图
b .亚胺(imine)、腙(hydraone)和肟(oxime)的稳定性比较
c. 常见的加速肟键形成的催化剂
d. 最新发现的肟键形成的低毒催化剂
烷氧胺-生物素试剂标记糖蛋白的实验案例
注:烷氧胺-生物素反应的最佳浓度和条件取决于特定的蛋白质和下游的应用场景。为获得最佳实验结果,可根据经验优化试剂与糖蛋白的摩尔比。
A. 所需试剂/耗材
1)烷氧胺-生物素溶液:将50mM烷氧胺-生物素试剂溶于DMSO中;配制足量的溶液以达到步骤B.3中所要求的最终浓度;
注:烷氧胺-生物素试剂是容易吸湿的固体,很难称量和转移。为了便于处理,可通过用DMSO配制250 mM储备溶液来解决。储备溶液的原液可在-20 °C冷冻条件下保存1个月;打开前需将试剂瓶平衡至室温,防止水分凝结;
2)耦合缓冲液:0.1 M磷酸钠、0.15 M氯化钠,pH=7.2的PBS缓冲液或其他中性或微碱性的非胺缓冲液;
3)配制浓度为2 mg/mL的糖蛋白;
4)透析盒或脱盐柱。
B. 实验步骤
1)将100 μg糖蛋白与5 μL 1 M的碳酸氢钠、100 μL PBS缓冲液混合,加入20 nmol Ald-PEG-NHS酯,并在室温下反应60分钟后用旋转脱盐柱纯化。经计算,脱盐后回收蛋白量约为75 μg;
2)在上述活化蛋白中加入15倍摩尔当量的烷氧胺-生物素溶液,并在室温下反应2小时;
3)通过透析或脱盐将生物素化蛋白与未反应的物质分离,并用与非生物素化样品相同的条件储存反应得到的生物素化蛋白质。