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胃蛋白酶的酶法测定

描述

本方法可用于以血红蛋白为底物的胃蛋白酶活性测定。这是一种分光光度速率终止测定法。

单位定义:一个单位的胃蛋白酶在37℃、pH2.0下,以血红蛋白作为底物,溶于三氯乙酸(TCA)的产物每分钟产生0.001的ΔA280。(最终体积=16mL,光程=1cm。)

所需试剂和设备

1.0M 盐酸

牛血血红蛋白(产品号:H195714

6.1N [~100% (w/v)] 三氯乙酸溶液(产品号:A291718

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水(25 °C时≥18 MΩxcm电阻率)制备试剂。

10 mM HCl(盐酸)——用超纯水将1.0M盐酸稀释100倍。

2.5% (w/v) 血红蛋白原液——使用牛血血红蛋白用超纯水配制25mg/mL溶液。用力搅拌,形成漩涡,在37°C下至少持续搅拌10分钟,然后用粗过滤器(90-130 mm)通过聚丙烯柱过滤。

底物[2.0% (w/v)血红蛋白溶液]——将80mL过滤后的2.5% (w/v) 血红蛋白原液转移到合适的容器中。使用5M HCl在37°C下将溶液的pH调至2.0。用超纯水将最终体积加至100 mL。

TCA溶液[5% (w/v)三氯乙酸]——用超纯水稀释6.1N[~100% (w/v)]三氯乙酸溶液20倍。

酶溶液(胃蛋白酶)–用冷的(2-8°C) 10mM HCl制备1mg/mL的原液。如果存在不溶物质,将原液置于冰上直至溶解。如果胃蛋白酶(产品号:P128678)已经溶解,或者如果不溶性物质仍然存在,在1小时后,将1mg/mL的原液用冷的10mM HCl溶液进一步稀释至0.01–0.05 mg/mL。

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操作流程
1.将底物移入合适的玻璃瓶中。

试剂

空白(ml)

试样1(ml)

试样2(ml)

试样3(ml)

底物

5.00

5.00

5.00

5.00

2.将小瓶置于恒温水浴中并平衡至 37°C约10分钟,然后添加:

试剂

空白(ml)

试样1(ml)

试样2(ml)

试样3(ml)

酶溶液

1.00

1.00

1.00

3.涡旋混合并在37oC孵育整整10分钟,然后添加:

试剂

空白(ml)

试样1(ml)

试样2(ml)

试样3(ml)

三氯乙酸溶液

10.0

10.0

10.0

10.0

酶溶液

1.00

4.涡旋混合并在37°C下再孵育5分钟。

5.通过0.45μm注射过滤器过滤空白和试样混合物。使用分光光度计,记录每个小瓶中每种过滤溶液相对空气的A280


结果

计算

单位/ml 酶=?(A280?试样– A280?空白) x (df)

(10) × (1.0) × (.001)

式中:

df =稀释因子

10 =以分钟计的测定孵育时间

1.0 =添加的酶溶液体积(ml)

0.001=每单位胃蛋白酶(单位定义)的ΔA280


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